引物是如何合成的及常见问题

1. 引物是如何合成的?

目前引物合成基本采用固相亚磷酰胺三酯法。DNA合成仪有很多种, 主要都是由ABI/PE 公司生产,无论采用什么机器合成,合成的原理都相同,主要差别在于合成产率的高低,试剂消耗量的不同和单个循环用时的多少。申能博彩公司采用的合成仪主要机型为ABI3900高通量合成仪,合成长链主要采用Beckman 1000M和PE8909 DNA合成仪,引物修饰和高OD数合成采用ABI394等。

亚磷酰胺三酯法合成DNA片段,具有高效、快速的偶联以及起始反应物比较稳定的特点。亚磷酰胺三酯法是将DNA固定在固相载体上完成DNA链的合成的,合成的方向是由待合成引物的3’端向5’端合成的,相邻的核苷酸通过3’→5’磷酸二酯键连接。

  • 第一步是将预先连接在固相载体CPG上的活性基团被保护的核苷酸与三氯乙酸反应,脱去其5′-羟基的保护基团DMT,获得游离的5′-羟基;
  • 第二步,合成DNA的原料,亚磷酰胺保护核苷酸单体,与活化剂四氮唑混合,得到核苷亚磷酸活化中间体,它的3’端被活化,5′-羟基仍然被DMT保护,与溶液中游离的5′-羟基发生缩合反应。
  • 第三步,带帽(capping)反应,缩合反应中可能有极少数5′-羟基没有参加反应(少于2%),用乙酸酐和1-甲基咪唑终止其后继续发生反应,这种短片段可以在纯化时分离掉。
  • 第四步,在氧化剂碘的作用下,亚磷酰形式转变为更稳定的磷酸三酯。

经过以上四个步骤,一个脱氧核苷酸被连接到固相载体的核苷酸上。再以三氯乙酸脱去它的5′-羟基上的保护基团DMT,重复以上步骤,直到所有要求合成的碱基被接上去。合成过程中可以观察TCA处理阶段的颜色判定合成效率。

通过氨水高温处理,连接在CPG上的引物被切下来,通过OPC, PAGE等手段纯化引物,成品引物用C18浓缩,脱盐,沉淀。沉淀后的引物用水悬浮,测定OD260定量,根据定单要求分装。

2.引物纯化方式有哪些,如何选择?

◆ C18柱脱盐:有人称其为简易反相柱,它对DNA有特异性的吸附,可以被有机溶解洗脱,但不会被水洗脱,所以能有效地去除盐分。它不能有效去除比目的片段短的小片段。实际上,它是一种脱盐的作用。这种方法一般不会对普通PCR反应产生影响。对于需要用于测序、克隆的引物不能使用这个级别。

◆ OPC纯化: OPC纯化是根据DNA保护基(DMTr基)和Cartridge柱中树脂间的亲合力作用的原理进行纯化目的DNA片段。OPC法纯化的DNA纯度大于95%。适用于40mer以下引物的纯化。

◆ PAGE纯:PAGE纯化法是使用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,对DNA片段进行分离,然后从凝胶中回收目的DNA的方法。PAGE纯化法也是一种非常有效的DNA纯化方法,纯化后的DNA纯度大于95%,对长链Oligo DNA (大于50mer)的纯化特别有效。

◆ HPLC纯化:HPLC纯化是使用高效液相色谱的原理,对DNA片段进行纯化。纯度可以大于99%。主要用于短链和修饰引物的纯化。该法的弱点是成本较高,批量生产效率不高。
3.引物的OD数如何定量?

答:引物合成引物OD数是这样测定的:用紫外分光光度计,波长260nm,石英比色杯,光程为1厘米,测定溶液的光密度。测定时溶液的光密度最好稀释到0.2-1.0之间。DNA干粉用一定体积的水充分振荡溶解以后,用1ml水稀释测OD值。需要根据稀释倍数换算出母液的OD值。

4.投诉定量不准是怎么回事儿?

答:我们偶尔收到用户投诉定量不准的报告,出现这种情况的可能性有

  • (1)生产人员定量错误。这种可能性有,但是不大,因为我们的生产人员都是经过严格的培训,程序化规范操作和换算。公司内部的考核机制也使得分装人员没有必要故意少给用户OD数,因为无论OD数是否达到定单要求,我们都统计为工作量,没有达到OD数的,分装人员将清单及时报到序列录入部门安排重合就可以了。合成产量的高低是序列录入部门人员的考核指标之一。一般情况下,引物都有留样。接到用户投诉后,我们都会找出留样重新定量,一般都没有问题。
  • (2)分装没有问题,但引物抽干或收样过程中,引物干粉可能意外丢失。这种情况很少见。
  • (3)系统误差,我们认为10%左右为允许误差。使用过程中,引物工作浓度范围很宽,定量上的少许偏差不影响实验。
  • (4)用户没有能够正确理解引物OD数的含义,没有能够正确使用分光光度计,特别是使用微量测定;用户没有将OD读数,正确地转换成母液中OD数。这种情况比较常见。
  • (5)用户收到引物干粉时,打开引物管盖前没有离心或其他误操作导致引物干粉部分丢失。

例如,验证标2OD引物量是否准确,简单的做法是: 加入1ml水,彻底溶解混匀后,取100ul, 加入900ul水,用光径为1cm的石英比色杯,波长260nm, 此时光吸收的读数为0.2。

5.需要什么级别的引物?

答:引物常用的纯化方式C18脱盐,OPC纯化,PAGE纯化,HPLC纯化。根据实验需要,确定订购引物的纯度级别。

应用

引物长度要求

纯度级别要求

一般PCR扩增

< 45base

OPC

 

>45 base

PAGE

诊断PCR扩增

< 40base

OPC, PAGE

DNA测序

20base左右

OPC

亚克隆,点突变等

根据实验要求定

OPC, PAGEHPLC

基因构建(全基因合成)

根据实验要求定

PAGE

反义核酸

根据实验要求定

PAGE

修饰引物

根据实验要求定

PAGE, HPLC

6.最长可以合成多长的引物?

答:引物越长,出现问题的概率就越大。我们合成过120base的引物,但是产率很低。除非需要,建议合成片段长度不要超过80mer,按照目前的引物合成效率,80mer的粗产品,全长(还不一定正确)引物的百分比不会超过40%,后续处理还有丢失很多,最后的产量是很低。

7.需要合成多少OD数?

答:根据实验目的确定。一般PCR扩增,2 OD引物,可以做200-500次50ul标准PCR反应。如果是做基因拼接或退火后做连接,1 OD就足够了。但是有些研究人员,就做几次PCR,但是却要5-10 OD。做全基因构建的引物都比较长,但是我们有些研究人员也要求高OD数。片段越长, 最后全长得率就越低,出错的几率就越大。超出需要之外的OD数要求,其实也是对社会资源的一种浪费,同时也从一个侧面反映了部分研究人员,特别是新手的自信心不足,总觉得需要重复多次才能成功。

8.如何检测引物的纯度?

答:实验室方便的作法是用PAGE方法。使用加有7M尿素的16%的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳。取0.2-0.5OD的引物,用尿素饱和液溶解或引物溶液中加入尿素干粉直到饱和,上样前加热变性(95℃,2mins)。加入尿素的目的一是变性,二是增加样品比重,容易加样。600V电压进行电泳,一定时间后(约2-3小时),剥胶,用荧光TLC板在紫外灯下检测带型,在主带之下没有杂带,说明纯度是好的。如果条件许可,也可以用EB 染色或银染方式染色。

9.如何计算引物的浓度?

答:引物保存在高浓度的状况下比较稳定。引物一般配制成10-50pmol/ul。 溶解前您需要核对合成报告单和引物标签上的引物OD数是否一致。如果不一致,请和我们联系。我们可以根据生产记录查到实际产量是多少。

一般情况下,我们建议将引物的浓度配制成50pmol/ul,加水的体积(微升)按下列方式计算:V (微升)= OD数*(乘)33 *(乘)*(乘)20000 / (除) 引物的分子量。引物的分子量可以从合成报告单上获得。如果需要配制成其他浓度,按上述公式换算。

注意:1 OD260= 33 ug/ml.

10.如何计算引物的Tm值?

答:引物设计软件都可以给出Tm,引物长度,碱基组成,引物使用缓冲的离子强度有关。

长度为25mer以下的引物,Tm计算公式为:Tm = 4℃(G + C)+ 2℃(A + T)

对于更长的寡聚核苷酸,Tm计算公式为:

Tm = 81.5 + 16.6 x Log10[Na+] + 0.41 (%GC) – 600/size

公式中,Size = 引物长度。

Tm的定义:Tm = Temperature at which 50% of a given oligonucleotide is hybridized to its complementary strand. In the absence of destabilizing agents, like formamide or urea, Tm will depend on 3 major parameters: The sequence: a GC-rich sequence has a higher melting temperature. The strand concentration: high oligonucleotide concentrations favor hybrid formation, which results in a higher melting temperature. The salt concentration: high ionic strength results in a higher Tm as cations stabilize the DNA duplexes.

11.引物(含修饰)的分子量是如何确定的?

答:非修饰的引物的Molecular Weight在随引物提供的报告单上都有明确的标示。如果需要估计一个引物的分子量按每个碱基的平均分子量为324.5,引物的分子量=碱基数 x 碱基的平均分子量。或按下列公式计算MW= (NA * WA) + (NC * WC) + (NG * WG) + (NT * WT) +(Nmod * Wmod) +(Nx * Wx)+( Ni* Wi) +16* Ns– 62.

NA, NG, NC, NT, Ni分别为引物中碱基A或G或C或T或I的数量,WA, WC, WG, W, Wi分别为引物中碱基A或G或C或T或I的分子量,Nmod,Wmod 分别为修饰基团的数目和分子量。

对于混合碱基的分子量为混合碱基的分子量总合除以混合数,例如G+A混合的分子量为(313.21+329.21)/2 = 321.21。Ns为硫代数目,硫代每个位置增加分子量16。

常规碱基分子量

Base

Molecular Weight

A

313.21

C

289.18

G

329.21

T

304.19

I

314.2

U

290.17

 

常规修饰基团分子量

5’-Biotin

405.45

3’-TAMARA

623.60

5’-(6 FAM)

537.46

3’-Dabsyl

498.49

5’-HEX

744.13

3’-(6 FAM)

569.46

5’-TET

675.24

3’-Amino Modifier C3

153.07

5’-Cy5

533.63

3’-Amino Modifier C7

209.18

5’-Cy3

507.59

3’-Thiol Modifier C3

154.12

12.如何溶解引物?

答:干燥后的引物质地非常疏松,开盖前最好离心一下,或管垂直向上在桌面上敲敲,将引物粉末收集到管底。根据计算出的体积加入去离子无菌水或10mM Tris pH7.5缓冲液,室温放置几分钟,振荡助溶,离心将溶液收集到管底。溶解引物用的水一般不要用蒸馏水,因为有些蒸馏水的pH值比较低(pH4-5),引物在这种条件下不稳定。

13.如何保存引物?

答:引物合成后,经过一系列处理和纯化步骤,旋转干燥而成片状物质。引物在溶解前,室温状态下可以长期保存。溶解后的引物-20度可以长期保存。如果对实验的重复性要求较高,合成的OD数较大,建议分装,避免反复冻融。修饰荧光引物需要避光保存。

14.合成的引物5’端是否有磷酸化

答:合成的引物5’为羟基,没有磷酸基团。如果需要您可以用多核苷酸激酶进行5’端磷酸化,或者要求我们合成时直接在5’或3’端进行磷酸化,需要另外收费。

15.引物片段退火后不能连接到载体上是什么问题?

连接反应需要引物的5’磷酸基团。如果需要将合成的引物退火直接连接相应的载体上,引物需要磷酸化。磷酸化的产物如果还不能连接载体上,需要检查载体的酶切效果,需要改善引物退火的条件。SiRNA分子具有特殊的对称结构,退火的难度较大,退火时需要提高退火温度。

16.测序发现引物有突变是怎么回事?

答:测序发现引物区域有突变,特别是40个碱基以下的引物, 发生的概率不大,但是肯定也会发生。用户一般可以放心,引物序列一般都是通过电脑直接将您的序列COPY到合成仪的,碱基输错的机会不多。我们有一套控制办法,预防碱基输入错误。发生这种突变的原因有很多解释,人们还没有办法彻底解决这个问题。引物合成的固相合成原理都一样,采用的机器也基本相同,合成主要原料都是由可数的几家跨国公司提供的,所有每个合成服务商遇到的问题也基本类似,没有人可以超脱。

引物合成是一种多步骤的化学反应,合成效率最高也就是99%,副产品不可以避免。引物序列中插入突变往往是碱基重复,一般认为,偶连过程中,正在偶连的部分单体发生丢失DMT,导致单体又接了上去,故发生插入同一碱基的突变。至于缺失突变,一般认为是一般认为是带帽(capping)反应不彻底造成的,Caping反应主要是封闭极少数5′-羟基没有参加反应单体。被封闭的引物,在下一轮偶连时将不能继续参与合成。

对于碱基置换的突变,产生的原因一般认为是碱基不能100%脱保护,即引物上可能含有残留保护基团,引物的这些区域不能很好地与互补链配对,当扩增的产品被亚克隆转化到大肠杆菌中,可能被细菌中修复系统补上了非配对的碱基。置换突变通常发生在G 转换成其它碱基。碱基G在一定条件下可以转化为烯醇异构体 (脱嘌呤),2,6 diaminopurine , DNA复制和扩增过程中DNA聚合酶将2,6 diaminopurine看作碱基A,测序就会发现碱基G-A置换。脱嘌呤现象在富含嘌呤的引物中发生的频率较高。脱嘌呤的引物在引物后处理脱保护阶段如果被降解,测序就会发现碱基G或A的缺失。

引物合成过程中,造成碱基插入,缺失,置换突变的因素客观存在,有不少降低发生的频率建议和措施,但是这些措施还停留在实验室阶段,还没有能够应用到规模化生产中。

17.长链引物为什么出错的几率非常高?

答:引物合成时,每一步反应效率都不能达到100%,产生碱基插入,缺失,置换突变的因素客观条件都有一直存在。引物链越长,突变的频率累加起来就越高。研究人员总希望合成的引物万无一失,这种心情可以理解。但是犹如PCR扩增,不可能绝对保证扩增产物中没有突变,引物合成也不可能保证100%正确。要知道,引物合成中发生错误(非人为因素)的频率,比任何高保真高温聚合酶PCR扩增过程所产生的频率都要高。做引物合成,长链引物合成,您要有引物中部分引物可能有突变的思想准备。

18.如果测序发现突变,该如何处理?

答:对您遇到的困惑,我们表示同情。遇到这种情况,首先和我们取得联系,我们的生产人员会检查生产的原始记录,主要是核对合成序列是否和定单一致,我们在电脑中保留所有原始数据。如果确认引物合成序列没有输错,我们建议重新挑取克隆测序,您可能会找到正确克隆的。根据我们经验,40个碱基以下的引物,测1-2个克隆就可以了;40个以上的特别是用于全片段拼接合成的,就需要多测一些了。一般情况下,每个克隆突变的位点都不一样,提示正确的总是有的,就是如何找到它。您也可以要求我们将引物免费重合一次,不过重合的引物和第一次的引物一样,都可能含突变,不会因为重合的引物就减少您的遇到问题的几率。基因拼接过程中,如果发现一段区域突变点不多,就多测几个,否则就重合一下引物。

19.如果测序发现引物突变,是否有补偿?

答:没有。我们可以免费重合一次,没有其他任何补偿或赔偿,不承担其他连带责任。原因我们在前面已提到,化学合成效率不可能达到100%。您选择了化学合成引物,合成过程中一些副产品所带来的后果就可能不可避免的遇到。

20.引物是经过PAGE纯化的,为什么还有碱基缺失或插入?

答:理论上分析型PAGE变性电泳,可以区分引物之间一个碱基的差别。但是制备PAGE电泳,上样量都是非常大,电泳时的条带非常宽,带与带之间有重叠,分辨率已下降,电泳后割带回收目的引物时,很难说不割到差别仅几个碱基的引物。国内有一个不好的现象,PAGE纯化的引物,特别是长引物要的量都比较高,导致割的条带有时可能比较宽。建议:您如果减少OD数,引物遇到的问题可能就会少一些。

21.为什么OPC或PAGE纯化的引物,再用HPLC鉴定纯度不高?

答: 有些用户引物需要纯度特别高的引物,在使用前会将HPLC鉴定引物的纯度,常常发现引物的纯度一般在70%左右。问题来了,还有那30%是什么? 引物纯化PAGE, 需要电泳,用缓冲液将引物浸泡出来,然后用C18浓缩,乙醇沉淀。沉淀得到的核酸物质基本引物了,除此以外,还有其他一些非核酸类物质,他们一般不会干扰引物的使用。OPC纯化也类似的情况。即使是HPLC纯化的引物,如果对成品进行分析,一般也难达到很高的纯度,引物您得到的纯品都是由制备柱过来,洗脱峰经过浓缩抽干,部分非核酸物质被富集。

22.为什么修饰引物的产量要比一般引物低,价格要高?

答:主要因为是修饰单体稳定性较差,偶连时间长,效率低,最后得到的产量自然低于一般的引物。修饰引物通常需要PAGE或HPLC纯化,纯化过程损失大。修饰引物使用的原料是一般引物原料的几百倍,所以产品的价格自然高。

23. TaqMan 探针设计的基本原则是什么?

答:下列原则供您参考。

◆TaqMan 探针位置尽可能靠近扩增引物(扩增产物50-150bp),但不能与引物重叠。

◆长度一般为18-40mer 。

◆G-C含量控制在40-80%左右。

◆避免连续相同碱基的出现,特别是要避免GGGG或更多G出现。

◆在引物的5’端避免使用G。

◆选用比较多的碱基C。

◆退火温度Tm控制在 68-70C左右。

24.Primer设计的基本原则是什么?

答:引物设计的下列原则供您参考。

◆引物长度一般在18-35mer。

◆G-C含量控制在40-60%左右。

◆避免近3’端有酶切位点或发夹结构。

◆如果可能避免在3’端最后5个碱基有2个以上的G或C。

◆如果可能避免在3’端最后1个碱基为A。

◆避免连续相同碱基的出现,特别是要避免GGGG或更多G出现。

◆退火温度Tm控制在 58-60C左右。

◆如果是设计点突变引物,突变点应尽可能在引物的中间。

25.用软件设计的引物为什么不管用?

答:引物是否好用,能否扩增出您需要的引物,与是否用软件设计没有太多的关系。引物设计有一定的指导意见,软件就是根据这些要求设计而成。不要迷信软件给您设计的引物,软件中一些参数您可能不明白,弄错了反而麻烦。其实,PCR扩增的成败最关键的是反应模板的制备和反应条件的控制。软件设计最大的毛病是,有时判断为该基因没有一段区域满足标准引物的要求。有时,我们需要扩增一段基因片段,引物的设计是没有太多的选择的。

26.为什么引物的OD260/OD280小于1.5 ?

答:我们多次接到类似的投诉:引物应该全是DNA,但是OD260/OD280的比值为什么那么低,怎么会有蛋白质污染?遇到这样的投诉有时我们感到很是为难。投诉者有时心情很不好,还不听解释。

撇开其他不谈,引物化学合成,哪里有机会污染到蛋白质?

需要指出的是OD260/OD280的比值不能用来衡量引物的纯度。OD260/OD280的比值过低一般是由于引物中C/T 的含量比较高所致。下表是一个20mer 同聚体引物的OD260/OD280的比值,清楚表明OD260/OD280的比值与引物的碱基组成密切相关。

27.同样的OD用PAGE检测,EB染色为什么深浅不一?

答:通常可以用EB染色的方法来判断双链DNA的量(如质粒DNA),因为EB可以嵌合到双链DNA中。而合成的单链DNA,由于碱基组成不同,形成二级结构的可能性不同,EB的染色程度也会有差异,比如Oligo(dT)等不形成二级结构,EB染色效果就非常差。所以不要用EB染色的方法来定量,而用紫外分光光度计检测。同样道理,用EB染色来照片不适合所有引物。

28.引物不纯会有什么后果?

答:引物不纯可能会导致:1)非特异性扩增;2)无法用预先设计在引物5’端酶切位点的酶切开,特别是没有保护碱基的引物;3) 用于测序出现双峰或乱峰。解决办法重新合成或重新纯化。

29.为什么我们的引物重合了几遍都扩增不出来?

答:有些PCR扩增没有成功,怀疑是引物不好。要求我们重合,没有问题。可是有时遇到重合数次的引物PCR扩增还是不成功。这种情况的出现一般都是用户自己的原因。对于引物合成,我们只能做到合成的引物没有问题,至于您是否能够扩增出来您需要的产物,那得靠您自己对实验本身的理解和把握。我们不能杜绝我们不犯错误,但是引物合成犯同样错误的几率很小,想犯同样的错误都难。

PCR扩增不成功的因素很多,需要您耐心地分析,最好在实验时设置对照来判定原因。
如果您怀疑引物的问题,请您首先测定您溶解的引物的OD值,看实验时加入的引物量是否正确。如果量是正常的,请您告诉我司您的引物编号,我们会复查留存样品。如不明原因,我们免费为您重新合成一次。如果仍然不能扩增,请您查找其它原因。

30.已经溶解的引物,为什么原先使用正常,而过一段时间再使用就不好了?

答:如果您溶解引物的水PH过低或污染了菌或核酸酶,会使引物降解。使用时没有充分解冻混合,液体不均匀也可能会造成引物加入量不准确。建议分装引物,避免反复冻溶。建议使用10mM Tris pH7.5缓冲液溶解引物,因为因为有些蒸馏水的pH值比较低(pH4-5), 引物在这种条件下不稳定。还有一种可能性是引物没有问题,而是PCR使用材料特别是模板的质量与先前使用的不完全一致。

31.引物质量好坏的判断标准是什么?

答:合成的引物和您的定单序列一致,而不是能否扩增出您所需要的产物。

32.PCR扩增不出就引物有问题吗?

答:基本不是。当今发展出各色各样的PCR扩增技术,各色各样的高温聚合酶,就是来解决PCR扩增中遇到的扩不出,扩增效率低的问题。如槽式PCR就是扩增那些拷贝数很低的基因片段。 有些重复片段的扩增, GC含量高的片段,非要采用特殊扩增手段才能扩增出了。

引物扩增不出,主要是下列两种情况比较常见(1) RT-PCR。请注意,很多基因通过常规RT –PCR方法是很难不增出来的。 RT- PCR成功的关键在于RT的反应的RNA质量和目标基因在特定组织和细胞中含量。(2)从基因组中扩增。一般情况下,基因在基因组中都是单拷贝,基因组作为模板需要严格控制用量。基因组DNA过高,会影响反应体系中的Mg和pH。

33.PCR扩增有很强的非特异条带,说明引物有污染吗?

答:不能。瞧,扩增目标很弱或没有,道是非特异性条带很亮,说明引物不纯或有污染。一些用户如是说。我们曾分析过一些非特异条带,测序发现在这些非特异性片段的两头至少可以发现一条引物序列。我们只能说非特异性扩增一般是模板污染(如RNA中污染基因组)或扩增条件不合适所致。

详情请看 引物设计专题

2 回复
  1. lIdan says:

    你的博客东西太好了,你可定是个大师级的人物。呵呵,每次要东西总能在你这里找到,崇拜中

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