引物设计的原理与Primer Premier5.0用法

一、设计原理
1.选择合适的靶序列:设计引物之前,必须分析待测靶序列的性质,选择高度保守、碱基分布均匀的区域进行引物设计
2.长度:一般来说,寡核苷酸引物长度为15-20bp.
3.Tm值:引物的Tm值一般控制在55-60℃,尽可能保证上下游引物的Tm值一致,一般不超过2℃。若引物中的G+C含量偏低,则可以使引物长度稍长,而保证一定的退火温度。
4.(G+C)含量:有效引物中(G+C)的比例一般为40~60%。
5.碱基的随机分布:引物中四种碱基的分布最好是随机的,不存在聚嘌呤和聚嘧啶,尤其在引物的3’端不应超过3个连续的G或C.
6.引物自身:引物自身不存在连续4个碱基以上的互补序列,如回文结构,发夹结构等,否则会影响到引物与模板之间的复性结合,尤其避免3’末端的互补。

二、引物设计操作流程
序列下载

同源性比较

引物设计筛选

1.序列查找
根据所需检测的病原体或者待检特定基因,在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/网址查询有关序列。

2、同源性比较 主要有两种方法
A、在www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/blast.cgi 网址进行在线的两两比较。

B、采用OMIGA, PCGENE等软件进行两两或多序列比较。

1、打开OMIGA软件,导入(import)下载存盘的纯文本序列文件:
2、选择待比较的多条序列,右键点击“align sequences”命令;
3、等待计算机处理,直至状态显示排列结束,点击“alignment”显示结果;
4、“alignment”结果,相同碱基以同色标记

三、引物设计与筛选 Primer Premier 5.0软件为例,进行引物设计和筛选的操作示范

1.打开软件,调入序列

primer-premier-5.0用法

2、选择路径,选择序列文件名,加入右框

primer premier 5.0用法

3、序列文件显示如图,点击“primer”;

primer premier 5.0用法

4、按照引物设计的原理,设定引物的各种参数,点击“确定”进行引物搜寻

5、等待引物搜寻,显示结束后,点击“确定”,进入下一页;

primer premier 5.0用法

6、按照搜寻结果显示,逐条分析,在主窗口中检查该引物对的二级结构情况,依次筛选

primer premier 5.0用法

~完~

更详细请看 引物设计专题

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