图文讲解如何用Blast验证引物

1、进入BLAST网页：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/

2、点击Search for short, nearly exact matches

3、 在search栏中输入引物系列：
 注：文献报道ABCG2的引物为5’-CTGAGATCCTGAGCCTTTGG-3’
                                                           5’-TGCCCATCACAACATCATCT-3’

（1）输入方法可先输入上游引物，进行blast程序，同样方法在进行下游引物的blast程序。
这种方法叫繁琐，而且在结果分析特异性时要看能与上游引物的匹配的系列，还要看与下游引物匹配的系列——之后看两者的交叉。

（2）简便的做法是同时输入上下游引物：有以下两种方法。输入上下游引物系列都从5’——3’。
 
A、输入上游引物 空格 输入下游引物

B、输入上游引物 回车  输入下游引物

4、  在options for advanced blasting中：
select from 栏通过菜单选择Homo sapiens【ORGN】
Expect后面的数字改为10

5、在format中：select from 栏通过菜单选择Homo sapiens【ORGN】. Expect后面的数字填上0  10

6、  点击网页中最下面的“BLAST！” 

7、  出现新的网页，点击Format！

8、 等待若干秒之后，出现results of BLAST的网页。该网页用三种形式来显示blast的结果。
（1）图形格式：

• 图中①代表这些序列与上游引物匹配、并与下游引物互补的得分值都位于40～50分
• 图中②代表这些序列与上游引物匹配的得分值位于40～50分，而与下游引物不互补
•  图中③代表这些序列与下游引物互补的得分值小于40分，而与上游引物不匹配
• 通过点击相应的bar可以得到匹配情况的详细信息。 

（2）结果信息概要：

从左到右分别为：

A、数据库系列的身份证：点击之后可以获得该序列的信息

B、系列的简单描述 

C、高比值片段对（high-scoring segment pairs, HSP)的字符得分。按照得分的高低由大到小排列。得分的计算公式＝匹配的碱基×2＋0.1。举例：如果有20个碱基匹配，则其得分为40.1。

D、E值：代表被比对的两个序列不相关的可能性。【The E value decreases exponentially as the Score (S) that is assigned to a match between two sequences increases】。E值最低的最有意义，也就是说序列的相似性最大。设定的E值是我们限定的上限，E值太高的就不显示了

E、最后一栏有的有UEG的字样，其中：

• U代表：Unigene数据库  
• E代表：GEO profiles数据库
• G代表：Gene数据库

（3）结果详细信息：

①圈出来的部分代表序列的信息

②第一个大括号代表上游引物与该序列的正链【Plus/Plus】的匹配情况：
共有21个碱基匹配，得分42.1分【21×2＋0.1＝42.1】，E值为0.020
上游引物与序列的2143～2163位点匹配

③第二个大括号代表下游引物与该序列的负链【Plus/Minus】的匹配情况：
共有20个碱基匹配，得分40.1分【20×2＋0.1＝40.1】，E值为0.077。
下游引物与该序列的29360～29379位点互补
 
注意点：
①上游引物为20个碱基，为什么会变成21个碱基呢？这是因为下游引物的第一个碱基为T，刚好与系列的2163位点的T匹配，因此下游引物的开头的第一个碱基被当成了上游引物了。同理，上游引物的最后一个碱基为G，被当成了下游引物了。通过寻找有没有与1～20位点、20～40位点完全匹配的序列，就可以避免这个因素的干扰了。 
 
②为什么与上下游引物匹配的ABCG2序列有多种？

• A、  为同一个基因来源的不同的mRNA片段
• B、 为该基因的DNA系列
• C、 为同一个基因来源的不同的cDNA克隆片段。

结果判断：
①验证文献报道的引物是否正确：如果你可以在所显示的结果中找出你的目的基因，一般说明你的引物正确性没问题。如果你blast后没有发现你的目的基因，或者分值很低，该引物就可能不适合用

②检测该对引物是否可与其它序列匹配，引起PCR的非特异性扩增。如果找到了你的目的基因名称，而且找到了一大批同物种的不同基因，（上下游引物分别搜索到相同的基因），而且分数也较高。这时表明你的引物设计的特异性不高，极有可能在你的扩增产物中出现非特异性产物。

(来源：生物秀)

详细请看 引物设计专题

本文补充说明请看： 图文讲解如何用Blast验证引物-补充说明