图文讲解如何用Blast验证引物
1、进入BLAST网页:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/
2、点击Search for short, nearly exact matches
3、 在search栏中输入引物系列:
注:文献报道ABCG2的引物为5’-CTGAGATCCTGAGCCTTTGG-3’
5’-TGCCCATCACAACATCATCT-3’
(1)输入方法可先输入上游引物,进行blast程序,同样方法在进行下游引物的blast程序。
这种方法叫繁琐,而且在结果分析特异性时要看能与上游引物的匹配的系列,还要看与下游引物匹配的系列——之后看两者的交叉。
(2)简便的做法是同时输入上下游引物:有以下两种方法。输入上下游引物系列都从5’——3’。
A、输入上游引物 空格 输入下游引物
B、输入上游引物 回车 输入下游引物
4、 在options for advanced blasting中:
select from 栏通过菜单选择Homo sapiens【ORGN】
Expect后面的数字改为10
5、在format中:select from 栏通过菜单选择Homo sapiens【ORGN】. Expect后面的数字填上0 10
6、 点击网页中最下面的“BLAST!”
7、 出现新的网页,点击Format!
8、 等待若干秒之后,出现results of BLAST的网页。该网页用三种形式来显示blast的结果。
(1)图形格式:
-
图中①代表这些序列与上游引物匹配、并与下游引物互补的得分值都位于40~50分
-
图中②代表这些序列与上游引物匹配的得分值位于40~50分,而与下游引物不互补
-
图中③代表这些序列与下游引物互补的得分值小于40分,而与上游引物不匹配
-
通过点击相应的bar可以得到匹配情况的详细信息。
(2)结果信息概要:
从左到右分别为:
A、数据库系列的身份证:点击之后可以获得该序列的信息
B、系列的简单描述
C、高比值片段对(high-scoring segment pairs, HSP)的字符得分。按照得分的高低由大到小排列。得分的计算公式=匹配的碱基×2+0.1。举例:如果有20个碱基匹配,则其得分为40.1。
D、E值:代表被比对的两个序列不相关的可能性。【The E value decreases exponentially as the Score (S) that is assigned to a match between two sequences increases】。E值最低的最有意义,也就是说序列的相似性最大。设定的E值是我们限定的上限,E值太高的就不显示了
E、最后一栏有的有UEG的字样,其中:
-
U代表:Unigene数据库
-
E代表:GEO profiles数据库
-
G代表:Gene数据库
(3)结果详细信息:
①圈出来的部分代表序列的信息
②第一个大括号代表上游引物与该序列的正链【Plus/Plus】的匹配情况:
共有21个碱基匹配,得分42.1分【21×2+0.1=42.1】,E值为0.020
上游引物与序列的2143~2163位点匹配
③第二个大括号代表下游引物与该序列的负链【Plus/Minus】的匹配情况:
共有20个碱基匹配,得分40.1分【20×2+0.1=40.1】,E值为0.077。
下游引物与该序列的29360~29379位点互补
注意点:
①上游引物为20个碱基,为什么会变成21个碱基呢?这是因为下游引物的第一个碱基为T,刚好与系列的2163位点的T匹配,因此下游引物的开头的第一个碱基被当成了上游引物了。同理,上游引物的最后一个碱基为G,被当成了下游引物了。通过寻找有没有与1~20位点、20~40位点完全匹配的序列,就可以避免这个因素的干扰了。
②为什么与上下游引物匹配的ABCG2序列有多种?
-
A、 为同一个基因来源的不同的mRNA片段
-
B、 为该基因的DNA系列
-
C、 为同一个基因来源的不同的cDNA克隆片段。
结果判断:
①验证文献报道的引物是否正确:如果你可以在所显示的结果中找出你的目的基因,一般说明你的引物正确性没问题。如果你blast后没有发现你的目的基因,或者分值很低,该引物就可能不适合用
②检测该对引物是否可与其它序列匹配,引起PCR的非特异性扩增。如果找到了你的目的基因名称,而且找到了一大批同物种的不同基因,(上下游引物分别搜索到相同的基因),而且分数也较高。这时表明你的引物设计的特异性不高,极有可能在你的扩增产物中出现非特异性产物。
(来源:生物秀)
详细请看 引物设计专题
本文补充说明请看: 图文讲解如何用Blast验证引物-补充说明
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我在这个网页上怎么没看到Search for short, nearly exact matches在哪啊?
@stellalong,
嗯,应该是改版了之后就没了。
用Primer-BLAST也是差不多的
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?LINK_LOC=BlastHome
用法明天找一找。
@stellalong,
已经附上补充说明,http://www.liucheng.name/?p=636
感谢你的支持。
@stellalong,
Primer-BLAST的教程搞定,请指点。
http://www.liucheng.name/?p=642
看不芯片
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